Immuncytochemie (Vectastain Universal Kit mit DAB-Färbung)
Materialien:
Diaminobenzidin
Kaisers Glyceringelatine (Merck)
Vectastain Universal Quick Kit (Katalog Nr. VC-PK-8800; ca. 224,- €)
(Enthält: Normalserum, biotingekoppelten Zweitantikörper, StreptavidinPOX Komplex
Zusätzliche Lösungen:
PBS 10x Stamm:
NaCl 1.3 mol/l 151.94g
Na2HPO4 x 2 H2O 70 mmol/l 19,87g
NaH2PO4 x H2O 30 mmol/l 8,28g
Mit H2Odeion auf 1800 ml auffüllen, dann rühren bis alle Substanzen gelöst
pH mit HCl auf 7,3 einstellen
Mit H2Odeion auf 2000 ml auffüllen
PFA 4%: Achtung: PFA schädigt Haut und Atemwege! Daher => Abzug !!!
PFA 40g
PBS 10x Stamm 100ml
Mit H2Odeion auf 800ml auffüllen
Auf ca. 60°C erwärmen
Zugabe von NaOH Plätzchen bis Substanz gelöst
pH mit HCl auf 7,3 einstellen
Mit H2Odeion auf 1l auffüllen
DAB-Stamm:
Achtung DAB ist karzinogen!! Daher => Abzug, Handschuhe, sauber arbeiten!!!
0,5g 3,3-Diaminobenzidin-tetrahydrochlorid
in 13 ml TrisHCl (0,05mmol/l) pH 7,7 auflösen
20 Aliquots a 200µl anfertigen, Rest in 2 ml Aliquots pipettieren und bei -80°C aufbewahren
Immuncytochemie (Vectastain Universal Kit mit DAB-Färbung)
Procedere:
Zellen in Multiwellplatten auf runden Deckgläsern aussähen
Nach Erreichen der Konfluenz Zellkulturüberstand abnehmen und Zellen 2x kurz mit PBS spülen
10' mit 4% PFA in PBS fixieren
2x 5' mit PBS waschen
10' mit einer 1:1 Mischung aus Aceton und Methanol bei -20°C fixieren
3x 5' mit PBS waschen
vorbereiten: Blockierungslösung Ansetzen (1 Tropfen Serum auf 2ml PBS)
vorbereiten: Multiwelldeckel mit Alufolie auslegen und pro Well 20µl Blockierungslösung auftropfen
Deckgläser kopfüber auf die Blockierungslösung legen
Deckel auflegen und 1h bei RT inkubieren
vorbereiten: 1. Antikörper 1:50 in Blockierungslösung verdünnen
vorbereiten: Multiwelldeckel mit Alufolie auslegen und pro Well 20µl der Primärantikörperlösung auftropfen
Deckgläser kopfüber auf die Antikörperlösung übertragen
Deckel auflegen und 1h bei 37°C inkubieren
Deckgläser mit den Zellen nach oben in Multiwellplatte mit PBS überführen
3x 5' mit PBS waschen
vorbereiten: Biotinylierten Sekundärantikörper ansetzen (2 Tropfen Serum und 1 Tropfen Antikörper auf 1ml PBS)
vorbereiten: Multiwelldeckel mit Alufolie auslegen und pro Well 20µl der Sekundärantikörperlösung auftropfen
Deckgläser kopfüber auf die Antikörperlösung legen
Deckel auflegen und 30' bei 37°C inkubieren
vorbereiten: Streptavidin/Peroxidase Komplex (1 Tropfen SPoxK auf 2ml PBS)
3x 5' mit PBS waschen
vorbereiten: Multiwelldeckel mit Alufolie auslegen und pro Well 20µl der SPoxK-Lösung auftropfen
Deckgläser kopfüber auflegen, Deckel auflegen und 90' bei RT inkubieren
3x 5' mit PBS waschen
vorbereiten: Peroxidase Substratlösung ansetzen (20µl DAB Stamm zu 1ml Tris-HCl pH7,7 und 2,5 µl H2O2 geben).
vorbereiten: Multiwelldeckel mit Alufolie auslegen und pro Well 20µl der Peroxidase Substratlösung auftropfen
Deckgläser kopfüber auflegen und jeweils 10' bei RT inkubieren
3x 5' mit PBS waschen
Deckgläschen kurz mit H2Odeion abspülen und auf einen Tropfen von Kaisers Glyceringelatine auf einem Objektträger auflegen
Nach ca. 1h Auswertung unter dem Mikroskop
Alternativ:
Entwässern durch je 2' Inkubation in 50%, 70%, 90% und 100% Ethanol
Deckgläser trocknen lassen
Eindecken mit Entellan auf Glasobjektträgern
Nach dem Aushärten (ca. 1-2 Tage) kann mit der mikroskopischen Auswertung begonnen werden