Immuncytochemie (Vectastain Universal Kit mit DAB-Färbung)

Materialien:

Diaminobenzidin

Kaisers Glyceringelatine (Merck)

Vectastain Universal Quick Kit (Katalog Nr. VC-PK-8800; ca. 224,- €)

(Enthält: Normalserum, biotingekoppelten Zweitantikörper, StreptavidinPOX Komplex

Zusätzliche Lösungen:

PBS 10x Stamm:

NaCl 1.3 mol/l 151.94g

Na2HPO4 x 2 H2O 70 mmol/l 19,87g

NaH2PO4 x H2O 30 mmol/l 8,28g

Mit H2Odeion auf 1800 ml auffüllen, dann rühren bis alle Substanzen gelöst

pH mit HCl auf 7,3 einstellen

Mit H2Odeion auf 2000 ml auffüllen

PFA 4%: Achtung: PFA schädigt Haut und Atemwege! Daher => Abzug !!!

PFA 40g

PBS 10x Stamm 100ml

Mit H2Odeion auf 800ml auffüllen

Auf ca. 60°C erwärmen

Zugabe von NaOH Plätzchen bis Substanz gelöst

pH mit HCl auf 7,3 einstellen

Mit H2Odeion auf 1l auffüllen

DAB-Stamm:

Achtung DAB ist karzinogen!! Daher => Abzug, Handschuhe, sauber arbeiten!!!

0,5g 3,3-Diaminobenzidin-tetrahydrochlorid

in 13 ml TrisHCl (0,05mmol/l) pH 7,7 auflösen

20 Aliquots a 200µl anfertigen, Rest in 2 ml Aliquots pipettieren und bei -80°C aufbewahren

Immuncytochemie (Vectastain Universal Kit mit DAB-Färbung)

Procedere:

Zellen in Multiwellplatten auf runden Deckgläsern aussähen

Nach Erreichen der Konfluenz Zellkulturüberstand abnehmen und Zellen 2x kurz mit PBS spülen

10' mit 4% PFA in PBS fixieren

2x 5' mit PBS waschen

10' mit einer 1:1 Mischung aus Aceton und Methanol bei -20°C fixieren

3x 5' mit PBS waschen

vorbereiten: Blockierungslösung Ansetzen (1 Tropfen Serum auf 2ml PBS)

vorbereiten: Multiwelldeckel mit Alufolie auslegen und pro Well 20µl Blockierungslösung auftropfen

Deckgläser kopfüber auf die Blockierungslösung legen

Deckel auflegen und 1h bei RT inkubieren

vorbereiten: 1. Antikörper 1:50 in Blockierungslösung verdünnen

vorbereiten: Multiwelldeckel mit Alufolie auslegen und pro Well 20µl der Primärantikörperlösung auftropfen

Deckgläser kopfüber auf die Antikörperlösung übertragen

Deckel auflegen und 1h bei 37°C inkubieren

Deckgläser mit den Zellen nach oben in Multiwellplatte mit PBS überführen

3x 5' mit PBS waschen

vorbereiten: Biotinylierten Sekundärantikörper ansetzen (2 Tropfen Serum und 1 Tropfen Antikörper auf 1ml PBS)

vorbereiten: Multiwelldeckel mit Alufolie auslegen und pro Well 20µl der Sekundärantikörperlösung auftropfen

Deckgläser kopfüber auf die Antikörperlösung legen

Deckel auflegen und 30' bei 37°C inkubieren

vorbereiten: Streptavidin/Peroxidase Komplex (1 Tropfen SPoxK auf 2ml PBS)

3x 5' mit PBS waschen

vorbereiten: Multiwelldeckel mit Alufolie auslegen und pro Well 20µl der SPoxK-Lösung auftropfen

Deckgläser kopfüber auflegen, Deckel auflegen und 90' bei RT inkubieren

3x 5' mit PBS waschen

vorbereiten: Peroxidase Substratlösung ansetzen (20µl DAB Stamm zu 1ml Tris-HCl pH7,7 und 2,5 µl H₂O₂ geben).

vorbereiten: Multiwelldeckel mit Alufolie auslegen und pro Well 20µl der Peroxidase Substratlösung auftropfen

Deckgläser kopfüber auflegen und jeweils 10' bei RT inkubieren

3x 5' mit PBS waschen

Deckgläschen kurz mit H2Odeion abspülen und auf einen Tropfen von Kaisers Glyceringelatine auf einem Objektträger auflegen

Nach ca. 1h Auswertung unter dem Mikroskop

Alternativ:

Entwässern durch je 2' Inkubation in 50%, 70%, 90% und 100% Ethanol

Deckgläser trocknen lassen

Eindecken mit Entellan auf Glasobjektträgern

Nach dem Aushärten (ca. 1-2 Tage) kann mit der mikroskopischen Auswertung begonnen werden