Herstellung von fluoreszenz-markiertem Aktin

1.  Herstellung einer Poly-L-Prolin Säule (PLP Säule)

• 2,5 g CNBr aktivierte Sepharose (Amersham) in einem Becherglas in 1 mM HCl quellen lassen (ca. 15 min,ist darin stabil)
• Matrix in eine Saugfritte gießen, Becherglas mit viel 1 mM HCl nachspülen
• Matrix mit >200 ml 1 mM HCl waschen
• mit 20 ml Kopplungspuffer waschen, Matrix (alle beads) in  ein Reaktionsgefäß überführen,
• Überstand abnehmen
• 13 ml poly-L-Prolin (10 mg/ml in Kopplungspuffer, total  130 mg) zur Matrix geben,
• 3h über Kopf rotieren (RT)
• Überstand abnehmen, Vollständigkeit der Kopplung überprüfen (Bradford)
• überschüssige reaktive Stellen mit 20 ml 1M Ethanolamin in Kopplungspuffer absättigen, 1 h RT
• in der Filternutsche waschen
• 3 x 40 ml Kopplungspuffer
• 3 x 40 ml 10 mM Na-acetat pH 4,5
• 3 x 40 ml Kopplungspuffer
• 3 x 40 ml 50 mM Tris/HCl pH 8, 500 mM NaCl
• Lagerung der Säule bei 4°C in 20% Ethanol oder mit 0,01% Azid im Puffer

Kopplungspuffer:

Reagenzien:

2.  Isolierung von Profilin

Expression in E. coli

• BL21DE mit pQE-profilin transformieren (immer frisch machen)
• Vorkultur über Nacht
• 1 l LB/Amp mit Vorkultur animpfen
• bei einer OD=0,5 mit 1 mM IPTG induzieren
• >4h bei 37°C schütteln
• Zellen sammeln, wiegen, einfrieren (-20°C)

Lyse der E coli

• Lyse der Zellen mit ca 1-3 ml/g Naßgewicht (auf Eis), 20-30g/4 l Kultur für 10 ml PLP Säule
• Zugabe von 1 mM PMSF
• Mikrofluidiser/french press
• zentrifiugieren, 20 min, 10 k, 4°C
• Überstand mit einer Pipetten in frischen Röhrchen überführen
• zentrifugieren, 20 min, 10k, 4°C
• Überstand retten

Reinigung

• PLP Säule mit 5 x vol Wasser waschen
• 5 x vol Lysispuffer
• Säule mit Extrakt beladen (0,5-1 ml/min), Durchfluß retten
• waschen mit Lysispuffer bis sich OD nicht mehr ändert (5-10 vol, 1 ml/min)
• waschen mit 5 vol lysispuffer+ 1 M harnstoff
• eluieren mit 20 mM Tris/HCl pH 7,5, 8 M harnstoff (0,5 ml/min, Fraktionen zu 1,5 ml)
• Säule äquilibrieren
• Lagerung der Säule in 20% Ethanol

Dialyse

• Fraktionen poolen, Dialyse jeweils gegen >100X vol, >3h, 4°C
• Dialysepuffer mit 4 M Harnstoff
• Dialysepuffer mit 2 M Harnstoff
• Dialysepuffer mit 1 M Harnstoff
• Dialysepuffer
• zentrifugieren, 10k, 20 min, 4°C
• Überstand retten, Bradford
• Gesamtausbeute berechnen, tubes beschriften
• in N2 einfrieren, bei -80°C lagern

Dialysepuffer:

3. Isolierung von g-Aktin

• Herstellung eine cytosolischen Extrakts (Fliegen, Schweinehirn,...) in Aktinlysispuffer (c= ca 10 mg/ml)
• kurz zentrifugieren, extraktion wiederholen
• Profilin zu 50 µM zugeben
• zentrifugieren, UZ, Ti70, 50 k, 90 min, 4°C
• PLP Säule mit 20 mM Tris/HCl pH 7,5, 3 mM ß-ME äquilibrieren
• zugeben von 10 mM EDTA
• auf die PLP Säule laden (0,5-1 ml/min), Durchfluß retten
• waschen mit 20 mM Tris/HCl pH 8, 300mM NaCl, 3 mM ß-ME (gründlich)
• elutieren mit Aktionelutionspuffer (<0,5 ml/min,  1 ml Fraktionen,
• Fraktionen poolen, Bradford und in N2 einfrieren
• Säule äquilibrieren (profilin Elutionspuffer!), in 20% Ethanol lagern

AktinLysispuffer

Aktinelutionspuffer

4. Markierung von Aktin