Färbung von ß-Galaktosidaseaktivität


Nachdem die Embryonen von der Eihülle befreit wurden, werden sie mit Heptan permeablisiert und mit Formaldehyd fixiert. Die Embryonen sind in einer Vittelinemembrane eingeschlossen, die vor der Färbung mit Triton pemeabilisiert wird. Die Färbung verläuft während mehrer Stunden in Gegenwart von einem Substrat der ß-Galactosidase, das nach Hydrolyse und Oxidation ein Indigoderivat bildet und blau ausfällt.

  1. 100-1000 Fliegen werden in einem Käfig für zwei Tage mit Hefe auf Apfelsaftagarplatten gut gefüttert.
  2. 0-6 h alte Embryonen werden gesammelt (Platte morgens wechseln, nach 6 h nochmal)
  3. Die Embryonen werden mit Klorix gerade bedeckt. Während 2-3 Minuten löst sich das Chorion auf.
  4. Die Embryonen werden in einem Netzchen gesammelt und mit Wasser gründlich gewaschen.
  5. Zur Fixierung werden die Embryonen in ein Szintillationsgefäß mit 5 ml n-Heptan und 4,6 ml PBS überführt. Zur Fixierung werden 0,4 ml 37% Formaldehyd zugegeben und geschüttelt. Die Embryonen schwimmen zwischen den zwei Phasen.
  6. Das Szintillationsgefäß wird für 20 min leicht bewegt oder entlang der Längsachse rotiert.
  7. Mit einer Pasteurpipette wird die wässrige  und die organische Phase vollständig entfernt.
  8. Die Embryonen werden in PBT suspendiert und mit einer Pasteurpipette in ein Reaktionsgefäß überführt.
  9. Die Embryonen werden dreimal mit PBT gewaschen.
  10. Die Embryonen werden mit Färbepuffer gewaschen und in ein Uhrglas oder einer Mehrkammerplatte überführt..
  11. X-gal Stammlösung wird zum Färbepuffer zu 0,2% Endkonzentration dazupipettiert. Die Inkubation erfolgt bei 30/37°C für mehrere Stunden.
  12. Wenn die Embryonen ausreichend gefärbt sind, werden sie in einem Reaktionsgefäß mit Färbelösung gewaschen. Vor dem Einbetten in einem Tropfen Glycerin läßt man die Embryonen in einem 1:2 Gemisch von Färbepuffer und Glycerin anschwellen.
  13. Alternativ können die gefärbten Embryonen mit Methanol:Heptan aus der Vittellinmembran befreit, mit 100% Ethanol, dann PBT gewaschen und schließlich in Glycerin eingebettet werden. Nach einem Ethanolwaschschritt erscheint die Blaufärbung besser.

Materialen, Geräte:

Biokular, Reaktionsgefäße, Uhrglas/Mehrkammerplatte,
Glycerin, Objektträger, Deckglas, Pasteurpipetten


Lösungen

PBT

PBS
0,1% TritionX-100

Färbepuffer

3.1 mM K3Fe(CN)6
3.1 mM K4Fe(CN)6
10 mM Na-phosphat, [pH 7,2]
150 mM NaCl
1 mM MgCl2
vor Gebrauch wird TritonX-100 zu final 0,1% dazugegeben

X-Gal Stammlösung

8% X-gal in DMF (Dimethylformamid)
bei -20°C lagern


Referenz:

Y. Hiromi, A. Kuroiwa, W. Gehring, Control elements of the Drosophila segmentation gene fushi tarazu. Cell 43 (1985) 603-613.